P450酶含有血红素且能催化羟化、环氧化、脱烷基化、碳-碳偶联、氧化裂解等各式各样不同反应，因而被称为“红色万能酶”，通过酶催化可取代日益严重的各种药物、化学品生产时造成的环境污染问题。但是自P450酶被发现数十年来，其晶体结构一直没能被解析出来，“万能”酶完整的催化机理一直困扰着科学界。近日，湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室的陈纯琪教授团队，和马立新教授、郭瑞庭教授成功破解难题，在P450酶完整催化机理的研究方面取得重要突破，该研究成果在最新一期国际权威期刊《自然·通讯》上发表。

难识P450酶真面目，解密遭遇瓶颈

“自然界中存在非常多不同种类的P450酶，它们参与细胞的生理调控、药物代谢以及许多重要药物的合成。”陈纯琪介绍，比如我们人类的染色体上就带有超过50个P450酶的基因，它们负责胆固醇、固醇类激素和维生素D等重要化合物的合成；许多具有药物活性的植物或微生物次级代谢物 (如青蒿素、紫杉醇)，也是由P450酶负责催化合成的；还有一些药物的化学结构非常复杂，单纯以人工合成的方法生产大量高纯度的药物极为困难，只有酶才能够精准调控复杂的合成途径。

科学家们发现，P450酶能够识别多种底物，由此利用基因工程改造P450酶来量身订制化学反应，成为一个热门研究方向。2018年诺贝尔化学奖得主阿诺德教授就是利用改造P450酶来进行各种困难或者特殊的化学反应。

一个完整的P450酶系统由三个部件组成：带有血红素的底物结合区；负责产生电子的还原酶；连接底物结合区和还原酶的通道。“这就像一个电器需要插上电才能工作，带有血红素的底物结合区就像电器本身，供电的插座就像还原酶，而电线就是连接两端的电子通道。”陈纯琪介绍，在建立一个P450酶反应系统时需要把所有组件都找齐了，组装在一起后才能够进行催化反应。有一些三种组件都串联在一起的P450酶，称作“自给自足P450酶”，这样的系统不需要另外寻找相匹配的供电器与电线，因此在应用的时候有巨大优势，也是方便科学家们研究的“明星P450酶”。

P450酶的血红素结合区识别底物机制的研究已经相当成熟，针对底物结合区的改造工程也有非常多的研究报道，但是对于电子如何从还原酶送入活性中心却仍有许多未知之处。要想知道电子是如何送入活性中心的路径，最直接的方法就是获得P450酶的晶体结构，这也等于完全看到酶的长相了。由于全长P450酶在表达、纯化后，酶蛋白很容易断裂、降解掉，因此难以获得蛋白质晶体，因此从1980年有了第一个P450酶的底物结合区晶体结构后，国内及国际上在全长P450酶的结构上，一直没有任何突破。

“看”清全长结构，解开P450酶催化路径

陈纯琪教授带领的结构生物学研究团队经过不懈的努力，找到了一个来源于耐热菌中的自给自足P450酶，这个P450酶在70度的高温下也特别稳定，也不会断裂或是降解，因此特别易于结晶。陈纯琪团队利用先进的X光晶体学技术，成功解析了“自给自足P450酶”的高分辨率完整的全长结构。

由于P450酶需要电子实现催化，就像是一台电器，需要插电才能运转，但我们却完全不知道插座、电线在哪。数十年来，科学家们只知道P450酶的反应需要电子，但不知道电子是怎么送进来的。因此陈纯琪团队的研究最终阐明了数十年间，电子是如何从还原酶区域送入底物结合区来进行反应的困惑。

“我们经过研究发现，整个P450酶的三个组成部件, 从基因序列的排序依序为: 血红素结合区—还原酶结构域—铁氧还蛋白结构域。这三个区域各带有一个辅因子，分别是血红素、黄素单核苷酸、[二铁二硫]，这三个辅因子也是P450酶内部电子传递时所需的中转站。电子传递就像送快递一样，需要经过几个中转站。”陈纯琪介绍，晶体结构显示，血红素结合区和还原酶分别位于整个蛋白质的两端，血红素结合区这一端朝外，露出开口以方便底物进入，而电子传递经过几个中转站，最终成功送达到血红素进行酶催化反应。

“黄素单核苷酸到[二铁二硫]的直线距离较近，为7.9埃(1纳米等于10埃)，这样的距离电子可以直接传递过去。但[二铁二硫]和血红素的直线距离则长达 25.3 埃，超过直接电子能传递的距离。但是[二铁二硫]与血红素之间没有其他的氧化还原中心存在来协助传送电子。”陈纯琪解释道，科研人员观察到中间有许多的氨基酸，这些氨基酸可能辅助电子从[二铁二硫]传送到血红素。后续针对这些氨基酸进行突变验证，果真证实了其中几个氨基酸确实对于P450酶的电子传递很重要。

根据这些结果, 关于P450酶的电子如何从黄素单核苷酸通过[二铁二硫]，传送到血红素的合理通路被完整地阐释。这也是迄今为止国内外首次解析“自给自足P450酶”的全长三维结构，是一个非常重要的里程碑，对于其他各类P450酶的改造与应用具有重要指导意义。

陈纯琪表示，省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室自2018年10月成立以来，重大成果不断，其研究团队目前正利用所获得的结构学信息，加速对P450酶进行更加深入的理性设计改造，以期培育出能催化更多重要反应的新酶，早日实现P450酶的绿色生物工艺制造，并应用于生物科技、制药工程与化工产业。